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標題：《THOC3轉(zhuǎn)運PFKFB4 mRNA促進肺鱗癌發(fā)展的機制研究》

摘要：背景與目的: 在肺惡性腫瘤中,肺鱗狀細胞癌(lung squamous cell carcinoma,LUSC)所占的比例約占30%,然而其臨床治療效果尚不理想。目前仍缺乏針對肺鱗癌的有效靶點,免疫療法對其的控制作用有限,化療和抗血管治療的毒副作用和耐藥性不容忽視。因此,明確促進肺鱗癌發(fā)展的關(guān)鍵分子和調(diào)控途徑及相關(guān)機制具有重要的臨床轉(zhuǎn)化價值。 核轉(zhuǎn)運蛋白是負責調(diào)控m RNA(messenger RNA,信使RNA)進出細胞核一組重要分子,在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用。THO復合物(THO Complex,THOC)是核轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白TREX(transcription-export,轉(zhuǎn)錄/輸出復合物)的重要組分,參與調(diào)控m RNA的轉(zhuǎn)錄和輸出過程。本文主要目的是研究THOC3在肺鱗狀細胞癌中的表達水平對腫瘤生長進展的影響,初步探討肺鱗癌中THOC3轉(zhuǎn)運m RNA調(diào)控下游的促癌機制,探索THOC3作為核轉(zhuǎn)運蛋白的在調(diào)控轉(zhuǎn)錄本穩(wěn)定性方面的功能,為進一步深入闡述THOC3基因介導肺鱗狀細胞癌進展的分子調(diào)控機制奠定理論基礎,有助于為肺鱗癌靶向治療提供新的理論依據(jù)。 方法: 1.利用腫瘤基因圖譜(The Cancer Genome Atlas,TCGA)、基因表達綜合(Gene Expression Omnibus,GEO)和基因表達譜交互分析(Gene Expression Profiling Interactive Analysis,GEPIA)數(shù)據(jù)庫研究肺鱗癌與癌旁組織中THOC3的表達情況;利用Kaplan-Meier(KM)繪圖儀公共數(shù)據(jù)庫繪制肺鱗癌患者中THOC3不同表達組的總體生存曲線。 2.收集90對肺鱗癌患者癌及癌旁組織,并通過免疫組化(immunohistochemistry,IHC)、實時熒光定聚合酶鏈鎖反應(quantitative real time polymerase chain reaction,q PCR)和免疫蛋白印跡實驗(western blot,WB)檢測THOC3的表達;通過q PCR實驗和WB實驗,檢測人原代支氣管上皮BEAS-2B(B2B)細胞和3株肺鱗癌細胞系(H1703,H520和SKMES1)中THOC3的表達;運用免疫熒光(immunofluoresence,IF)細胞染色法檢測THOC3在細胞核質(zhì)中的定位狀況。 3.使用RNA干擾(RNA interferience,RNAi)技術(shù)抑制肺鱗癌細胞中內(nèi)源性THOC3表達,篩選穩(wěn)定低表達的細胞系,建立亞細胞系。體內(nèi)外檢測THOC3對增殖、遷移、侵襲和成瘤的影響:通過細胞計數(shù)(cell counting kit-8,CCK8)實驗和細胞克隆實驗觀察THOC3對肺鱗癌細胞增殖的影響,細胞損傷修復實驗和Transwell實驗觀察THOC3對肺鱗癌細胞的遷移和侵襲能力的影響;BALB/c裸鼠成瘤實驗驗證THOC3對肺鱗癌細胞成瘤能力的影響。 4.對正?；蚯玫蚑HOC3的肺鱗癌細胞進行轉(zhuǎn)錄組測序,京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of genes and Genomes,KEGG)通路富集和基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis,GSEA)差異表達的基因;q PCR和WB實驗檢測糖酵解通路相關(guān)基因PFKFB4在肺鱗癌中的表達。利用RNAi和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)完成回復實驗,構(gòu)建沉默和過表達PFKFB4的sh THOC3細胞系;通過體內(nèi)外細胞功能實驗、細胞凋亡和糖酵解相關(guān)代謝水平的檢驗分析,進一步檢測THOC3轉(zhuǎn)運PFKFB4 m RNA對肺鱗癌發(fā)展的影響。 5.IF和qPCR檢測敲低THOC3對PFKFB4 mRNA核質(zhì)分布的影響,通過質(zhì)譜(mass spectrum,MS)鑒定和基因本體功能(Gene Ontology,GO)分析查找THOC3互作蛋白,免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,CO-IP)和IF檢測THOC3和YBX1的結(jié)合,轉(zhuǎn)錄組測序檢測二者共調(diào)控基因,q PCR、WB實驗檢測THOC3或YBX1敲除后PFKFB4的表達水平。利用RNA-蛋白結(jié)合預測數(shù)據(jù)庫cat RAPID探索THOC3與下游m RNA可能的結(jié)合位點,完善RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀(RNA binding protein immunoprecipitation,RIP)、RNA下拉實驗(RNA pull down)檢測敲低THOC3或YBX1后下游PFKFB4 m RNA的穩(wěn)定性改變。 結(jié)果: 1.TCGA研究結(jié)果顯示,THOC3在肺鱗癌中的表達高于癌旁組織,KM分析顯示,THOC3高表達患者的預后較差。 2.THOC3在肺鱗癌臨床樣本中的表達高于癌旁樣本,THOC3主要富集于肺鱗癌細胞質(zhì)中,在肺鱗癌細胞中的表達顯著高于正常肺上皮細胞。 3.在肺鱗癌細胞系成功構(gòu)建低表達THOC3的亞細胞系,經(jīng)體外實驗結(jié)果顯示,THOC3敲低后可抑制肺鱗癌細胞的增殖、遷移和侵襲,經(jīng)體內(nèi)實驗結(jié)果顯示,THOC3敲低后抑制肺鱗癌在裸鼠體內(nèi)成瘤。 4.THOC3低表達的肺鱗癌細胞,下游糖酵解通路受到抑制,代謝相關(guān)基因PFKFB4的表達也隨之下降,導致肺鱗癌細胞糖酵解水平降低,影響細胞代謝從而影響肺鱗癌細胞增殖、轉(zhuǎn)移等多種生物學行為,繼而誘發(fā)細胞凋亡。 5.IF、RIP和RNA下拉實驗證實了THOC3和PFKFB4 mRNA的相互結(jié)合,結(jié)合位點位于PFKFB4 m RNA的3′UTR端。質(zhì)譜鑒定了THOC3的互作蛋白是RNA結(jié)合蛋白YBX1,CO-IP和IF實驗證實了二者的結(jié)合互作。YBX1是m5C修飾閱讀器,PFKFB4 m RNA的3′UTR端有m5C修飾,THOC3與YBX1結(jié)合,識別PFKFB4 3′UTR端的m5C修飾從而穩(wěn)定轉(zhuǎn)運m RNA至細胞質(zhì)發(fā)揮促癌作用。 結(jié)論: 1.THOC3的表達水平可能與肺鱗狀細胞癌患者的生存預后有密切聯(lián)系;THOC3有一定潛力可作為肺鱗癌診斷與評估臨床預后的腫瘤標志物。 2.THOC3促進肺鱗狀細胞癌的惡性進展,THOC3可以結(jié)合下游糖酵解相關(guān)基因PFKFB4 m RNA,將其從胞核轉(zhuǎn)運至胞質(zhì),促進細胞糖酵解影響細胞代謝,抑制細胞凋亡,進而促進肺鱗癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力。 3.THOC3與PFKFB4 mRNA的結(jié)合區(qū)域3′UTR端存在m5C修飾,THOC3可以和m5C閱讀器YBX1結(jié)合,通過識別m5C位點調(diào)控PFKFB4轉(zhuǎn)錄本出核過程。調(diào)控mRNA的穩(wěn)定性。